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eTPD：开启新药发现之门

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2023-12-17 15:26

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靶向蛋白降解(TPD)是近十年来出现的一种主要的新的药物降解方法。细胞内靶向蛋白降解(iTPD)已成为小分子药物的一种重要的新的药物模式，它可通过双特异性小分子将目标蛋白(POI)招募到E3连接酶中进行蛋白酶体降解。与经典的占位型药物不同， iTPD消除了靶蛋白并具有催化作用，因此可以更有效和更持久，而且剂量要求更低。iTPD的代表种类为PROTAC和分子胶，目前已有二十多项临床实验正在进行，其中一些已进入II/III期临床。

最近，人们也已开始对降解细胞外蛋白，包括可溶性和膜POI的兴趣激增(表1)。细胞外靶向蛋白降解(eTPD)可利用双特异性抗体、偶联物或小分子将胞外POI转运到溶酶体进行降解。目前已经初步建立了几个利用不同的天然循环和内化机制的eTPD平台。在这里，我们按照这些平台出现的大致时间顺序做一个简要介绍。

表1. iTPD和eTPD的比较

用于降解可溶性POI的“sweeping” 抗体

抗体的Fc区域在抗体回收和免疫细胞激活中起着重要作用。FcRn负责将内吞的抗体重新释放到细胞外，使其在进入溶酶体降解之前返回细胞外，抗体与FcRn的结合可以延长其在人体内的半衰期达到21天。

在一种称为“sweeping” 抗体的方法中，Igawa等人巧妙地设计了抗体，利用FcRn以可调节pH的方式将POI递送到酸性内体中，然后在内体中释放POI以进行溶酶体降解（图1）。这一方法受到了LDL的自然回收机制的启发，LDL与LDL受体结合后在低pH下释放到内体中进行溶酶体降解。

图1. “sweeping” 抗体用于降解可溶性POI

Igawa的团队将tocilizumab （Tcz）进行了工程改造，这是一种用于治疗类风湿性关节炎的已批准的人源化抗体，使其在pH依赖性下与IL-6R结合。Tcz既与膜结合型IL-6R结合，也与可溶性IL-6R结合。然而，由于IL-6R的高表达水平，Tcz被迅速清除。该团队将Tcz改造为一种“sweeping” 抗体，共分为两步。首先，他们工程化改造改善了其与FcRn的亲和力来增加半衰期。

接下来，他们在与IL-6R结合的界面上的CDR和一些FR残基进行扫描引入组氨酸。组氨酸为带正电的碱性氨基酸，是质子的供体和受体，其pKa 为6 右。酸性条件下组氨酸会发生质子化，当组氨酸位于抗原抗体相互作用的交界面时，如果它是二者相互作用的关键氨基酸，质子化的发生会直接影响二者的结合作用；如果组氨酸是维持构象的骨架氨基酸，质子化的发生会造成构象的变化而动摇二者的结合。

在抗体的适当表位引入适当数量的组氨酸，就可能赋予抗体pH依赖性抗原结合的特性。经过改造的Tcz在pH 6.0时（晚期内体的pH值）亲和力降低约20倍，而维持在pH 7.4时的亲和力。因此，改造后的Tcz可以将IL-6R递送到溶酶体降解，但抗体本身仍与FcRn保持结合，并回收回到细胞膜以获取更多的IL-6R，实现了抗体的循环使用。与原始Tcz相比，pH可调节的改造抗体清除IL-6R所需的剂量降低了20倍，这使其可以通过皮下途径给药。

作为一个重要的成果，pH可调节抗体satralizumab于2020年获得批准，用于治疗神经视神经炎光谱障碍。这是eTPD类别中首个获得批准的抗体。

尽管“sweeping” 抗体具有实用性，但制备它们存在一些重要挑战。在CDR和FR中寻找合适的组氨酸组合以在内体中提供稳定的pH开关，并找到不会在中性pH下破坏目标表位亲和力的残基十分具有挑战。迄今为止，这一过程是通过组氨酸扫描和不同CDRs中的试错组合来完成的。

“sweeping” 抗体代表了eTPD的首个系统和成功的例子，将成为是一种重要的药物模式，尤其是用于清除高丰度的可溶性配体。

基于糖基的回收受体对膜和可溶性POI进行降解

目前有两种主要的糖基降解剂方法用于eTPD：ASGPR（asialoglycoprotein receptor）和CI-M6PR（cation-independent mannose 6-phosphate receptor）（图2）。这两种方法在组织分布上有很大的差异；ASGPR在肝脏中高表达，而CI-M6PR广泛表达，但主要存在于免疫细胞中。

图2. 基于糖基降解剂的eTPD

CI-M6PR是一种300 kDa的二聚型I型受体，其已经被验证可以将内源性或工程修饰的M6P标记蛋白传递到溶酶体。这种受体在中性pH下结合货物，在酸性内体中释放。CI-M6PR已经被利用来将带有M6P的外源性溶酶体酶运送到溶酶体以治疗溶酶体贮积病，并且也被用于降解糖基化的白血病抑制因子（LIF）和巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）的衍生物。

最近的研究表明，可以利用CI-M6PR进行eTPD。一些研究团队构建了一种称为溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）的结构，其中将六到八个不可水解的含有甘露糖6-磷酸酯（M6Pn）的糖基随机生物偶联到POI靶向抗体的赖氨酸残基上。LYTACs可能是具有普适性的eTPD平台。研究表明，标记有糖基的抗体对特定细胞系中的目标蛋白摄取速度可以比非特异性对照快10到100倍。

研究还展示了利用糖基连接的已批准的EGFR抗体cetuximab （Ctx）的版本进行eTPD的潜力。在细胞实验中，其在24小时内可以降解HeLa细胞上约70％的EGFR，而CI-M6PR的水平没有变化。

类似地，糖基连接的抗体也可以通过atezolizumab （Atz）的LYTAC，使转铁蛋白回收受体CD71降解高达80％，使PDL1降解高达70％。

ASGPR主要在肝细胞上高度表达，并能快速清除非唾液酸糖蛋白。ASGPR已被用于通过将Tri-GalNAc靶向配体连接到siRNA来将siRNAs带到肝脏。最近的研究表明，ASGPR也可以用于降解肝细胞上的蛋白质，这为开发肝脏相关疾病的治疗提供了新的途径。

Bertozzi团队的研究结果显示，将大约十个GalNac靶向配体与抗体结合，可以将这些抗体转化为降解蛋白质的工具。他们成功地将这种方法应用于EGFR和HER2等蛋白质的降解，并与基于CI-M6PR的LYTAC的效果相当。这些研究结果表明，ASGPR可以作为一种有效的靶向策略，可用于降解肝脏中过量表达的蛋白质。

Tang团队的研究结果进一步证实了ASGPR在降解蛋白质中的潜力。他们发现，将GalNac靶向配体与生物素、抗体或抗体片段结合，可以实现对可溶性和膜蛋白的降解，并且较小的蛋白质复合物更容易被ASGPR摄取和降解。

LYTAC平台降解膜蛋白和可溶性蛋白的潜力导致了第一家专门从事eTPD的公司Lycia Therapeutics的成立，其成立于2020年。

利用跨膜E3连接酶进行膜蛋白的eTPD

除了含有600-700个胞质环结构域的E3连接酶外，还有一个约有30多个跨膜环结构域的E3连接酶家族。近年来的研究已开始探索是否可以通过antibody-based PROTACs （AbTACs）以利用这个家族的成员来降解膜蛋白（图3）。其中一个研究较为深入的成员是RNF43，它是一个包含外域、跨膜域和E3连接酶RING结构域的蛋白质。RNF43通过泛素化其受体Frizzled来调节Wnt信号通路，并通过溶酶体降解进行破坏。通过构建AbTACs，可以利用RNF43的胞内域来降解其他膜蛋白，如PDL1。

图3. 利用跨膜E3连接酶进行膜蛋白的eTPD

针对RNF43和其他成员，研究人员通过系统的蛋白质工程结构-活性关系（SAR）研究，探索了亲和力、表位和降解剂如何影响降解效率。他们发现，在RNF43上识别出的多个抗体中，有一个的降解效率接近90%。通过丙氨酸突变产生的亲和力调节变异体系列显示，亲和力在100-1000倍范围内降低5-10倍时，降解效率仍然保持稳定，并且抗体结合位点的选择比亲和力更为重要。

AbTACs也可以应用于RNF43的近亲ZNRF3，并显示出较高的降解效率。在实验中，AbTACs的双特异性IgG格式比串联格式更有效。此外，AbTACs对Wnt信号的干扰较小，因为R-spondin可以克服并允许Wnt信号的传递。

总之，AbTAC技术为eTPD治疗提供了新的机会，该技术已经推动了EpiBiologics公司的成立，专注于eTPD治疗。

利用细胞因子和生长因子循环受体进行膜蛋白的eTPD

KineTACs是一种新颖的eTPD，利用细胞因子和白细胞介素与其受体结合并进入溶酶体进行降解。KineTACs通过构建一个分子，其中一个臂含有细胞因子或白细胞介素，另一个臂含有特异性的抗体，能够靶向并降解特定的蛋白（图4）。

图4. 利用细胞因子和生长因子循环受体进行膜蛋白的eTPD

KineTACs已被证明对多种膜靶点和可溶性蛋白质有效，包括PDL1、HER2、EGFR、CDCP1和TROP2等。其平台通过利用循环受体的不同组织分布和水平，扩展了eTPD的选择，与基于E3连接酶的双特异性分子类似，KineTAC完全是基因编码的，构建相对简单，其中一个臂来源于天然的趋化因子或细胞因子，不需要构建包含两个链的Fab。

KineTACs在降解靶点方面似乎具有催化作用，因研究表明，在降解PDL1或EGFR期间，CXCR7的水平不会改变。并且，KineTACs能够降解高表达水平的膜靶点，即使靶点的转录水平比CXCR7高十倍。

KineTACs的构建也有一定的灵活性，可以根据生物学的兼容性或细胞因子臂的物理性质的不同，选择使用不同的抗体。KineTACs不需要对靶点细胞内结构域进行泛素化，因此适用于降解可溶性蛋白质。KineTACs在小鼠中具有类似于正常IgG的PK特性，并且在动物实验中没有引起明显的体重变化。

总之，KineTACs是一种有前途的eTPD方法，具有广泛的应用前景。虽然目前还需要进一步的研究来证明其在动物中的有效性，但其构建简单、具有灵活性和广泛性的特点，使其成为一种有吸引力的eTPD方法。

利用整合素进行eTPD

近日，Fang团队的研究引起了广泛关注。他们开发了一种基于整合素的降解系统，该系统可以将药物精确地输送到癌细胞中，并将其降解（图5）。整合素是一种细胞黏附分子，在细胞-细胞外基质连接中起着关键的中介作用。在癌症模型中，这些蛋白质通常过度表达，因此它们成为了一个有吸引力的降解系统。这种系统可以将包含简单的Arg-Gly-Asp （RGD）基序的配体与整合素结合，并将其输送到溶酶体中。

图5. 利用整合素进行eTPD

这项研究的原理验证使用了整合素αVβ3结合的生物素嵌合物来靶向生物素结合蛋白NeutrAvidin。这种分子将一个环状RGD基序（cRGD）共价连接到生物素上，成功地在A549细胞中触发了NeutrAvidin的内化，并在20小时内通过共聚焦显微镜观察到。此外，NeutrAvidin的内化与LysoTracker共定位，并且受到溶酶体转运抑制剂的阻断。随后，使用与相同cRGD肽链连接的ApoE4结合分子的降解物显示了ApoE4的内化作用。

Zheng等人研究了连接链长度的影响，并发现最短的连接链构建导致了对PDL1的最高效降解，在MDA-MB-231细胞中24小时内可达到73%的降解率。

转运抑制剂研究表明降解发生在溶酶体而不是蛋白酶体中。此外，降解需要将POI靶向和整合素靶向的两侧嵌合物进行共价连接。

这种基于整合素的降解系统为肿瘤选择性降解膜或可溶性蛋白提供了巨大的潜力。

从细胞内部降解膜POI

多个研究小组已经针对受体酪氨酸激酶（RTKs）使用包含经典E3连接酶结合物的PROTACs连接到各种RTK抑制剂上，从而实现对RTKs的靶向和降解（图6）。

图6. 从细胞内部降解膜POI

Crews实验室首次报道了一种包含EGFR的小分子抑制剂和VHL连接酶结合物的PROTACs，其可以在24小时内降解EGFR的Dmax为69-99%。不同的EGFR结合头部可引发不同的降解表型。

其他研究小组也开展了类似的研究，如将拉帕替尼与VHL靶向配体连接的PROTAC，可以降解HER2和EGFR。

C4 Therapeutics还开发了一种小分子降解剂CFT8919，用于EGFR （L858R），并已获得了FDA的新药调查许可。

相对于仅抑制RTKs，降解RTKs具有几个优点。例如，MET的PROTAC比阴性对照异构体更有效地降低了细胞存活率，并且具有持久的反应。此外，降解引起的激酶组重塑较少，这是RTKs简单抑制剂的常见耐药机制。降解机制被证明完全依赖于蛋白酶体，并且与基于抗体的E3连接酶降解剂不同。

Jin实验室的研究表明，使用已批准的EGFR抑制剂吉非替尼，与已建立的CRBN或VHL E3连接酶的小分子偶联物连接的其他PROTACs可以诱导EGFR的剂量反应性降解。无血清饥饿增强了降解作用，推测它可能促进受体内化以促进泛素化。

虽然PROTACs具有内部降解RTKs的潜力，但在细胞渗透性方面存在限制。PROTACs不如生物制品强效，这是其主要限制因素。Orum Therapeutics公司正在开发抗体偶联物来输送PROTACs，可能能够克服一些细胞渗透性问题。尽管这一技术仍处于初级阶段，但使用靶向膜蛋白内部结构域的PROTACs进行膜蛋白降解有望为治疗RTKs相关疾病提供新的治疗方法。

— 小结 —

eTPD领域目前处于起步阶段，正在紧随iTPD领域的步伐发展。研究人员正在探索各种设计来推动eTPD的发展。然而，eTPD依然面临着许多重要的问题需要解决。首先，需要确定哪些靶点适合eTPD，并且哪些蛋白靶点对于特定的治疗领域最为重要。此外，需要确定eTPD在慢性疾病和急性疾病中的应用价值。eTPD是主要针对可溶性蛋白还是膜蛋白，还是两者兼而有之？另外，组织选择性对于安全有效的eTPD药物有多重要？是否存在多种有效的降解剂，还是只有少数几种？

虽然面临诸多问题，但毫无疑问eTPD领域有着巨大的潜力，我们可以期待eTPD的进一步发展，并且预计不久会有更多的突破和创新。

参考文献：

1.Extracellular targeted protein degradation: an emerging modality for drug discovery.

2.Targeted pro tein degradation and drug discovery.

3.PROTAC targe ted protein degraders: the past is prologue.

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